Zur Therapie verwendete Strahlung ist „ionisierende Strahlung“. Die klassische und am meisten verwendete ionisierende Strahlung ist hochenergetische Röntgenstrahlung, die auch Photonenstrahlung genannt wird.
Es können neben Photonen aber auch geladene Partikel zu diesem Zweck verwendet werden: Elektronen, Protonen oder Kohlenstoffionen. An der Universitätsklinik für Radioonkologie werden Photonen und Elektronen verwendet; Protonen- oder Kohlenstoffionentherapie steht am Partikeltherapiezentrum MedAustron in Wiener Neustadt zur Verfügung, mit dem enge Kooperation besteht. Wie bei Röntgenaufnahmen spürt man bei der Strahlentherapie keine Erwärmung oder Schmerz, die Strahlen sind unsichtbar. Die Strahlung bleibt im Behandlungsraum, es besteht keine Gefahr für Kontaktpersonen.
Die Wirkung im Gewebe (Tumor wie normales umgebendes Gewebe) führt von physikalischen Effekten (Ionisierung) über chemische Effekte zur biologischen Wirkung. Die biologische Wirkung ist vor allem auf Schäden in der DNA, also dem Erbmaterial der Zellen im Zellkern, zurückzuführen. Diese Schäden sind vor allem dann relevant, wenn Zellen sich teilen. Deshalb sind Gewebe mit hohem Zellumsatz empfindlicher für kurzfristige Schäden. Dies gilt auch für Tumorgewebe, das meist eine erhöhte Zellteilungsrate aufweist und daher empfindlicher auf ionisierende Strahlen reagiert als gesundes Gewebe.
Die entstandenen DNA Schäden werden teilweise durch molekulare Mechanismen in den Zellen repariert – erwünscht bei gesundem Gewebe, nicht erwünscht bei Tumoren. Die Fähigkeit zur DNA Reparatur ist in verschiedenen Geweben unterschiedlich ausgeprägt, zumeist in gesunden Geweben besser als in Tumorgewebe. Wird die Strahlentherapie in vielen kleinen Dosen angewandt, ergibt sich dadurch oft eine bessere Verträglichkeit der Strahlendosis im normalen Gewebe als im Tumor. Durch die sogenannte „Fraktionierung“ (die werktägliche Bestrahlung über mehrere Wochen) kann deshalb die Dosis im Tumor erhöht werden und wird trotzdem vom normalen Gewebe gut toleriert. Durch höchste Präzision in der Strahlentherapie können in bestimmten Situationen zunehmend höhere Dosen pro Fraktion angewendet werden, womit die Therapie insgesamt kürzer dauert und dennoch immer besser verträglich wird. Bei sehr umschriebenen und kleinen Tumoren kann eine besonders hoch dosierte Bestrahlung des Tumors in sehr wenigen Sitzungen erfolgen: dies wird stereotaktische Radiotherapie genannt.